花药发育与花粉形成是开花植物有性生殖过程的重要环节，细胞核雄性不育（genic male sterility，GMS）基因是参与调控这一环节的重要因素。转录因子对下游基因的调控作用，以及microRNA对转录因子的转录后调控作用是基因调控网络的重要组成部分。玉米GMS转录因子和miRNA都有报道，但数目较少，且缺乏基因组水平上对花药发育不同时期的综合研究，阻碍了玉米雄性发育分子遗传调控网络的解析和构建。

2021年04月22日，北京科技大学、北京中智生物农业国际研究院万向元教授团队在The Crop Journal上在线发表了题为“Genome-wide analyses on transcription factors and their potential microRNA regulators involved in maize male fertility”的研究论文。该文通过玉米花药发育全时期转录组测序（RNA-seq）分析，结合细胞学、生理学分析和CRISPR/Cas9基因敲除研究，发现玉米花药发育过程中基因转录水平变化规律与细胞学和生理学变化规律的紧密对应关系；并在转录组水平鉴定到1087个与玉米雄性发育相关的转录因子基因、118个miRNAs和99对miRNA-转录因子基因调控关系；进一步通过miRNAs和基因表达分析验证了zma-miR159和zma-miR319对本研究新鉴定的雄性不育转录因子基因ZmGAMYB表达抑制作用，证明了miRNAs和转录因子协同调控玉米雄性发育。

首先，该研究聚焦玉米基因组中的转录因子基因，通过分析玉米自交系W23花药12个时期的RNA-seq数据，鉴定到时期差异表达的转录因子基因1087个，采用基因表达早晚模式聚类分析把其中的1079个基因分为六类。对这六类转录因子基因及其共表达或被其调控基因的功能进行GO和KEGG富集分析，发现基因表达水平变化规律与花药/花粉发育过程中细胞学和生理学变化规律具有很好的对应关系，主要包括：细胞周期和细胞有丝分裂相关基因在减数分裂前高表达，与该时期花药壁细胞和造孢细胞活跃的有丝分裂相对应；孢粉素合成和花粉壁形成相关基因以及氧化还原相关基因在减数分裂期间高表达，与该时期花粉壁形成过程以及活性氧积累诱导之后的绒毡层细胞凋亡（PCD）活动相符合；离子转运和跨膜转运相关基因在减数分裂后高表达，与减数分裂之后花药外壁角质和蜡质层以及花粉壁形成所需脂类物质的转运相对应；光合作用基因在减数分裂期间及之后高表达，与花药内皮层细胞叶绿体在减数分裂之后发育成熟，开始行使光合作用功能相一致。这是首次利用花药发育全生育期细胞学和生理学表型变化规律解释该发育过程相关基因功能的生物意义。

图1：玉米雄性发育过程相关基因功能聚类与细胞学和生理学变化规律的对应关系

然后，该文通过分析本研究中新测序的和已发表的转录组数据，发现在玉米ocl4、ms23、ms7-6007以及lob30转录因子基因GMS突变体和野生型花药的转录组之间，上述六类转录因子基因（1079个）中绝大多数的表达有显著的差异。同时，通过分析玉米花药miRNA测序数据，鉴定出118个时期差异表达的miRNAs，这些miRNA在上述4个GMS转录因子基因突变体和野生型花药之间显示不同程度的差异表达。进一步综合分析RNA-seq和miRNA-seq数据，鉴定出99对可信度较高的miRNA-转录因子基因调控关系（图2），可归类为至少25个调控模块，其中至少10个调控模块在玉米或其它植物中被报道参与调控花药和花粉发育。

图2：99对miRNA-转录因子基因调控关系影响玉米雄性发育的分析

最后，该文利用CRISPR/Cas9基因敲除实验，发现玉米转录因子基因ZmGAMYB及其同源基因ZmGAMYB-2为新的玉米雄性不育转录因子基因，进一步通过基因表达水平qRCR实验验证了zma-miR159和zma-miR319对ZmGAMYB基因（属于上述99对miRNA-转录因子基因调控关系）的表达抑制作用（图3）。这些结果表明本文鉴定的转录因子基因、miRNAs及miRNA-转录因子调控关系能参与调控玉米花药和花粉发育过程。

图3：zma-miR159和zma-miR319对本研究新鉴定的雄性不育转录因子基因ZmGAMYB的表达抑制作用

总之，本研究发现的与玉米雄性发育过程密切相关的转录因子基因、miRNAs、miRNA-转录因子基因调控关系、以及对部分miRNA-转录因子基因调控关系验证结果，可极大丰富玉米雄性不育候选基因资源，扩展玉米雄性发育分子遗传调控网络信息，有助于深入解析玉米雄性不育的分子机理。

北京科技大学生物与农业研究中心讲师李紫文、博士生朱涛涛和柳双双为该文的共同第一作者，万向元教授和安学丽教授为该文的共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金项目（31771875、31971958、31871702）、中央高校基本科研业务费（2302019FRF-TP-19-013A1、06500136）和国家重点研发计划（017YFD0102001、2018YFD0100806、2017YFD0101201）的支持。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cj.2021.03.016